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ELISA檢測試劑盒的操作步驟
更新時(shí)間:2015-06-25   點(diǎn)擊次數(shù):1041次

    ELISA檢測試劑盒可用于測定抗原,也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑:①固相的抗原或抗體,②酶標(biāo)記的抗原或抗體,③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件,可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。
(一)雙抗體夾心法
雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,操作步驟如下:
(1)將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
(2)加受檢標(biāo)本:使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間,讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
(3)加酶標(biāo)抗體:使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
(4)加底物:夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
根據(jù)同樣原理,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物,即可用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體。
(二)雙位點(diǎn)一步法
在雙抗體夾心法測定抗原時(shí),如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體,則在測定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步(圖15-5)。這種雙位點(diǎn)一步不但簡化了操作,縮短了反應(yīng)時(shí)間,如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體,測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA檢測試劑盒提高到新水平。
在一步法測定中,應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hookeffect),類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時(shí),過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成夾心復(fù)合物,所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
(三)間接法測抗體
間接法是檢測抗體zui常用的方法,其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。
(1)將特異性抗原與固相載體連接,形成固相抗原:洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
(2)加稀釋的受檢血清:其中的特異抗體與抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合,在洗滌過程中被洗去。
(3)加酶標(biāo)抗抗體:與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合,從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。ELISA檢測試劑盒例如欲測人對(duì)某種疾病的抗體,可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。
(4)加底物顯色:顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。

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