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人ELISA試劑盒試驗詳細(xì)來實踐
更新時間:2015-05-25   點擊次數(shù):1028次

    因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面,業(yè)已起到了類似封鎖劑的作用。并非所有的人ELISA試劑盒固相均需封鎖,封鎖不當(dāng)反而會使陰性本底增高。脫脂奶粉也是一種良好的封鎖劑,其zui大的特點是價廉,可以高濃度使用(5%)??贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液,也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封鎖劑使用,但因為奶粉的成份復(fù)雜,而且封鎖后的載體不易長期保留,因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。封鎖的手續(xù)與包被相類似。一般說來,雙抗體夾心法,只要酶標(biāo)記物是高活性的,操縱時洗滌*,不經(jīng)封鎖也可得到滿足的結(jié)果。封鎖是否必要,取決于人ELISA試劑盒模式及詳細(xì)的實驗前提。封鎖(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中,在低溫可保留數(shù)月。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化,每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。但在間接法測定中,封鎖一般是不可少的。

    1、有的包被原可能不是蛋白,對于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被,我把方法扼要的列出如下:①親和素生物素:先親和素先包被載體,加入生物素化的DNA,這種包被方法平均、牢固,已擴大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。②小分子必需依賴和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。包被原的性質(zhì)很重要,蛋白濃度,是否降解,人ELISA試劑盒這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別,所以保留抗原很重要,我做重組蛋白時,師兄都嚴(yán)格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。③脂類物質(zhì):可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干,待酒精揮發(fā)后,讓脂質(zhì)天然干固在固相表面。

   2、應(yīng)留意以下原理:因為蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的,靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用,這種物理吸附長短特異性的,受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響,大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團,故更易吸附到固相載體表面。包被液的選擇,一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時因為試驗的需要,包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。詳細(xì)的試驗還要有堅固的理論外也要實踐,看一下*可不可以應(yīng)用到自己試驗當(dāng)中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液,還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。

    3、但*選用什么,要依據(jù)。常用封鎖劑有:0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉,可以高濃度使用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等。封鎖就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些曠地空閑,從而排斥人ELISA試劑盒后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封鎖:繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。

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